土壤中放线菌的分离（土壤中放线菌的分离和纯化）

经过怎样处理才能从土壤中分离到链霉菌以外的放线菌

目的和要求

1、了解采集土样的要求和方法。

2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。

3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。

4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。

二、原理

筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。

由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。

三、实验材料

1、培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。

2、灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。

3、试验菌：

（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

（2）大肠杆菌（Escherichia coli）

（3）金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）

（4）深红酵母（Ruodotorula rubra）

4、其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔，打孔器，游标卡尺、镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。

如何从土壤中分离得到一株可以产生某种从未被发现的新的抗生素的放线菌？

是这样的，放线菌好分离，因为每一株都有可能带有某种从未被发现的新的抗生素，难得是后面的检测抗生素的过程。

连续稀释分离法

①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。

②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。

③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。

④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种放线菌。

⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。

平板划线分离法

①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。

②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。

③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。

注：如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

土壤放线菌的分离和纯化要注意哪些问题

（1）能分解尿素的细菌将尿素氧化成氨气，代谢类型为异氧需氧型．（2）尿素为唯一碳源的培养基上，只有能分解尿素的菌才能以尿素作为氮源生长繁殖，不能分解尿素的菌因缺乏氮源无法生长繁殖，因此分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用尿素为唯一碳源的培养基进行分离，分解尿素的菌在分解尿素时产生氨气，使酚红指示剂显红色，所以要加入酚红指示剂进行鉴别．（3）若取土样5g，应加入45ml的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液，样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落的数目，选用一定稀释范围的样品进行培养，取样稀释前，一定要将菌液摇匀以减少误差；将103-107倍的稀释液分别吸取0.1mL加入到固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上．（4）将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计具有红色环带的菌落既是分解尿素的菌的菌落，估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30 到300之间的平板，分析表格是数据可知，105和106的稀释度平板菌落数在这一范围．故答案应为：（1）异氧需氧型（2）尿素为唯一氮源 酚红（3）45（4）摇均（震荡、混匀） 涂布器（玻璃刮刀） 稀释涂布（平板）法（5）红色环带 105或106

急，请问如何从土壤中分离出细菌、放线菌、霉菌、酵母菌、真菌

首先用灭菌水稀释土壤，充分摇匀，就可以用玻棒蘸取土壤溶液，在经过灭菌的特制培养基培养皿上划线，然后进行培养。一般我们培养细菌和酵母菌用LB培养基，青霉菌用PDA培养基，其他的没坐过不太清楚。等培养出来后挑出单一菌落进行继代培养，用显微镜观察是什么菌。

土壤里的细菌习性差别很大，生长条件要求也很不一样，有固氮菌，硅酸盐细菌，菌根菌，很多很多种，有很多种是很难在一般培养基中生长的，需要有特殊的环境，但也有很多种可以在普通的培养基上培养，生长比较快，可以培养出五彩斑斓的菌落。

对好氧菌培养相对容易一些，如果要培养厌氧菌条件特殊，需要加入特殊的药品，或者采取深层培养或其他的厌氧条件。

土壤中微生物特别丰富，含有放线菌、真菌等，在培养过程中，可以使用选择性培养基，加入一些抑制其生长的药品，尽可能消除其干扰。

土壤中放线菌的分离为什么加重铬酸钾

放线菌分离遇到的最重要问题之一是既要抑制细菌、真菌的生长。研究青霉素、萘啶酸、制霉菌素、重铬酸钾和氟哌酸5种抑制剂对分离土壤放线菌的影响,其中以重铬酸钾的分离效果最好，试验结果分析得到最优抑制剂组合为重铬酸钾0.6 mg.L-1,制霉菌素10 mg.L-1,萘啶酸10 mg.L-1,其中制霉菌素在3个因子中起的作用最大。