如何采取有效的措施预防和控制猪场大肠杆菌病的制备方法

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法

【技术领域】

[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪疫苗的制备方法，具体为一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法。

【背景技术】

大肠杆菌病是一种由致病性大肠埃希菌引起的急性、多形性、肠道传染病，可严重影响仔猪的成活率。其临床表现主要为仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病。其中黄痢多见于7日龄以内的哺乳仔猪（病猪主要排出黄色或黄白色水状粪便）；白痢多见于10-30日龄仔猪（病猪粪便呈乳白色或灰白色）：水肿病多见断奶前后仔猪（病猪常出现神经系统症状，以胃水肿为特征）壁、肠系膜和其他组织）。这三种疾病对生猪生产危害极大，居养猪业之首，严重威胁养猪业的健康发展，导致饲料收益降低，仔猪成活率降低，生长缓慢，生长发育停滞（所谓生长发育停滞）。死猪），甚至死亡。本病发生的原因很多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时也有交叉感染，给临床防控带来困难，造成大量仔猪死亡，并带来给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效措施防治猪场大肠杆菌病已成为养猪生产中的一个重要问题。以及生长发育停滞（所谓的生长发育停滞）。死猪），甚至死亡。本病发生的原因很多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时也有交叉感染，给临床防控带来困难，造成大量仔猪死亡，并带来给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效措施防治猪场大肠杆菌病已成为养猪生产中的一个重要问题。以及生长发育停滞（所谓的生长发育停滞）。死猪），甚至死亡。本病发生的原因很多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时也有交叉感染，给临床防控带来困难，造成大量仔猪死亡，并带来给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效措施防治猪场大肠杆菌病已成为养猪生产中的一个重要问题。导致临床防控困难，造成大量仔猪死亡，给养猪业带来巨大经济损失。因此，如何采取有效措施防治猪场大肠杆菌病已成为养猪生产中的一个重要问题。导致临床防控困难，造成大量仔猪死亡，给养猪业带来巨大经济损失。因此，如何采取有效措施防治猪场大肠杆菌病已成为养猪生产中的一个重要问题。

目前，猪大肠杆菌病已在世界范围内发生，而且这种病在我国也相当普遍，因为每个场的饲养管理、卫生条件、防疫程序等都不一样，所以大肠杆菌的发病率是也有所不同。有资料显示，在华东部分规模化养猪场，仔猪黄白腹泻平均发病率为29. 0% ±3. 096，平均死亡率为2< @k24% ±1. 9% ; 猪水肿病平均发病率为17. 7% ±3. 5%，平均死亡率为11. 0% ±1. 3%。

猪大肠杆菌病严重，细菌多重耐药现象十分严重，4种及以上耐药菌株占受试菌总数的96%，其中76.5%菌株耐药6～10种药物。药物防治越来越困难。因此，猪大肠埃希菌疫苗的研制逐渐被人们所认识和重​​视。由于大肠杆菌的血清型非常复杂，而且市面上出售的猪大肠杆菌疫苗与各地病原猪大肠杆菌的血清型不同，免疫效果并不理想。

【发明内容】

[0004] 本发明旨在提供一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，目的是解决由于大肠杆菌血清型非常复杂，市面上销售的猪大肠杆菌疫苗与致病性猪大肠杆菌血清型共存存在免疫效果不理想的技术问题。

本发明通过技术方案实现：

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1) 细菌分类选择；

2) 培养基配置；

3)菌液制备；

4) 活菌计数；

5)菌株灭活；

6) 疫苗制备；

进一步，所述步骤具体为：

步骤(1)专门从采集的疑似猪大肠杆菌病的病材中分离出060、011和01383致病血清型的猪大肠杆菌菌株，作为育苗菌株。

步骤（2)为特制培养基，营养琼脂培养基组成：蛋白胨11.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂1<@k180g，水，pH值7. 3±0. 1；麦康凯琼脂培养基成分：蛋白胨21g，牛胆汁盐5g，氯化钠5g，琼脂14g，乳糖10g，中性红<@k203g，水，PH7. 4；马丁肉汤培养基成分：葡萄糖5g，蛋白胨2.5g，?3H20 0?5g，MgSO4?7H20 0.25g，0.1%红孟加拉溶液1.65ml，琼脂7. 5～10g，蒸馏水500ml，自然pH，2%脱氧胆酸钠溶液10ml（预先灭菌，立即使用前加入），链霉素溶液（/ml）1.65ml（加入使用前）。

步骤(3)具体是将各分离菌株分别接种于肉汤中，37°C培养1d，然后划线接种于琼脂平板上培养，从中选出光滑表面，隆起，呈10个典型的粉红色菌落，再次接种肉汤，37℃培养1d，纯检后作为种子，用种子液接种于营养琼脂上，37℃培养18h猪水肿病的治疗方法，室温放置，灭菌灭菌，生理水浸泡5～Smin，然后刮去菌苔，用消毒纱布过滤入消毒瓶中，得到各菌株的菌悬液。

步骤(4)具体为分别取各菌株的菌悬液1 mL，进行10倍递增稀释，然后按常规方法进行活菌计数，各菌株菌悬液中活菌含量细菌不少于100亿个CFU/mL。

步骤(5)具体是根据活菌计数的结果，将菌株O6(|、O1(11、O 138 以4:3:2的比例混合，加入人浓度3%甲醛，37℃灭活ld，此期间每4h摇晃一次。

步骤（6)特指经过灭活的大肠杆菌混合菌液，检验合格后，按照每毫升含蜂胶9-10mg的混合菌液的比例加入蜂胶提取物，在灌装过程中加入边沿并摇匀以制备浑浊的菌苗。

本发明蜂胶4℃以下冷藏保存，使用前粉碎，筛分需要在4℃～8℃的温度下进行，按照质量体积比1:4的比例加入95%乙醇，浸泡室温放置1-2 d，冷却，离心取上清液，得到棕红色纯蜂胶。除去干燥的残留物，将浸没溶液存放在 4°C 以下的冰箱中以备后用。

本发明的有益效果是：

1)以蜂胶为佐剂，蜂胶制剂注射方便，吸收快，注射部位无病变，不影响胴体质量；

2)采用优势血清型的致病性大肠埃希菌06(|猪水肿病的治疗方法，O1(11、O 138株作为苗种混合，研制猪大肠埃希菌多价蜂胶灭活疫苗；

结果显示，接种疫苗后，由大肠杆菌引起的仔猪黄白腹泻发病率为7.69%，死亡率1.92%；未免疫仔猪黄白腹泻发病率为32.65%，死亡率14.29%。经统计分析，差异极显着，说明疫苗免疫效果较好。

【详细方法】

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下仅为本发明的较佳实施例，不对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本行业的技术人员都可以利用上述-对上述公开的技术内容进行等同变化的等效实施例。凡依据本发明的技术实质对上述实施例所作的简单修改或等同变化，均应包含在本发明的保护范围之内。

应用实例一

实施例1

一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

A.来自安阳区米集疑似猪大肠杆菌病的病材，为060、01011和01383种病原猪大肠杆菌菌株，作为育苗制剂，血清型分株；

B.培养所得菌株，使用的种子培养基为麦康凯琼脂，扩增培养基为普通琼脂培养基；

C.血清型分别为060°C，将Oltl1和01383种病原猪大肠杆菌菌株接种于肉汤中，37°C培养1d，然后划线接种于琼脂平板上培养